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Sep 11, 2023 01:57 PM
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成年哺乳动物的上皮组织通过常见成熟细胞的增殖或组织驻留干细胞的自我更新和分化来维持生命。移植外源性上皮干细胞为可能补充或重构内源修复细胞提供了机会,这一技术在源自外胚层的上皮(如皮肤、眼睛)移植中已成功实现过。然而,对于内部组织,除了少数例外,想要实现类似的移植困难重重,阻碍了对呼吸道等病变内上皮采取成功长期治疗的机会。重构内部上皮组织的组织驻留干细胞室理论上具有产生耐久和功能性移植的优势,因为移植成功后的干细胞可在体内进行多能分化和自我更新。肺的传导气道是细胞移植中广受关注的部位,但由于受到气道表面的管腔细胞和高效的先天免疫系统的保护,气道的基底细胞(BCs)室仍然难以用细胞或基因靶向。尽管已实现了从外源(如从胎儿或成人肺组织中收集)原代细胞到免疫缺陷小鼠气道或肺泡上皮中的成功移植,但气道干细胞室的持久性重建仍未取得突破性进展。体外多能干细胞(PSCs)诱导生成的气道 BCs 及其等效物(表达 BC 标记物的细胞培养物)都是用于移植的强大的细胞类型,因为它们可以在细胞培养中得以维持和扩增,从而生成大量保留干细胞表型的细胞,这对于移植来说是必需的。此外,这两种细胞类型都可以被冷冻储存或基因操作,这些特征将便利未来的细胞治疗手段,为未来细胞移植治疗提供可能性,特别是在当前干细胞研究和基因操作技术日益成熟的情况下,这将为很多疾病的治疗带来新的可能。
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2023 年 8 月,美国波士顿大学 Darrell N. Kotton 团队取得一项重大新突破,其研究成果在《Cell Stem Cell》杂志发表, Kotton 等通过移植培养的原代或多能干细胞(PSCs)来源的小鼠或人源气道基底细胞(BCs)实现了小鼠体内气道基底干细胞(iBCs)室的长期重构。这项研究为未来气道上皮疾病基于细胞的治疗方式铺平了道路,也为进一步研究和理解气道上皮的再生和修复机制提供了一个有效的实验模型。
首先在移植之前,Kotton 团队需要开发出重构小鼠气管驻留干细胞室的方法,这需要确定一种通用的无血清、无饲养层培养基用于小鼠原代 BCs 和 iBCs 的扩增培养,以获取移植所需的大量细胞。为此,Kotton 团队改进了先前的方法获得包括人源 iBCs 在内的多样性肺上皮祖细胞, 同时针对小鼠 PSCs 到 iBCs 地分化进行了条件优化。流式分选结果发现优化后的基础培养基(BCM)上调了 PSCs 源气道类器官中 BCs 标记物神经生长因子受体(NGFR)表达;在第 40~44 天,大约有 54.73% ± 16.00% 的细胞共表达 Nkx2-1mCherry 和 NGFR,而在传代扩增后,细胞中共表达百分比含量增加到 73.86% ± 9.42%。进一步地定量和定位分析比较流式分选细胞群与新鲜的原代气管上皮细胞,发现在 NGFR + 种群中,BC 经典标记物 Krt5 和 Trp63 的表达等于或超过原代气管上皮细胞,这提示 Nkx2-1mCherry+/NGFR + 确实为 iBCs。此外,研究人员发现 iBCs 可以连续传代至少 10 次仍然保持其增殖潜能,且冷冻保存过的细胞仍然可以维持 Nkx2-1mCherry 和 BC 标记物的表达,而对 P6 代后 iBCs 生长特征情况的单细胞测序(scRNA-seq)分析结果也进一步证实了之前的发现。
为了确保相同的培养条件同样适用于原代 BCs 地移植,研究人员将小鼠气管中分离出的原代 EPCAM + 细胞放在 BCM 中培养,发现只在一部分 NGFR + 细胞中存在 BC 标记物 Krt5 和 Trp63 的表达上调。且与 iBCs 相反,原代 BCs 的增殖速率在 P5 时减慢,传代扩增无法超过 P5。总的来说,以上结果表明研究人员成功从 PSCs 衍生出小鼠 iBCs,并且顺利研发出一种无血清,无饲养层的培养基,方便在相同培养条件下扩增培养原代 BCs 和 iBCs 进行对比移植研究(图 1)。
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图 1:小鼠 iBCs 和原代 BCs 在确定的无血清培养基中培养扩增
在得到了满意的实验结果后,研究人员首先利用优化后的 BCM 建立小鼠 BC 和 iBC 的气道移植方法。首先对移植小鼠原代 BC 是否能实现气道上皮细胞重构进行了验证,通过对小鼠气管注射聚多卡醇建立小鼠气道损伤模型,等待 5 小时让聚多卡醇为外源性细胞提供基底膜上可着陆位点后,再检测移植源自 UBC-GFP 小鼠的原代 BC 到同基因受体受损气道上皮的可行性。结果发现,对照组中未检测到移植 BCs 表达;相反,实验组中,移植后不同时间段都可观察到供体来源 GFP + 细胞在受损气道中表达,且荧光和流式结果均表明供体来源 BCs 显著重构气道上皮。进一步地定位分析发现供体细胞定位于气管上皮并表达与肺细胞发育有关的 NKX2-1 核蛋白,但在黏液下腺未被检测到,此外,还共表达 GFP 和 KRT5+、SCGB1A1 + 或 ACTUB + 的气道标记物。换言之,供体细胞有能力分化为三种不同类型的气道细胞:BCs、分泌细胞和纤毛细胞,并在肺细胞发育中保留了其原本的功能,而 NKX2-1 可能在其中发挥着核心作用。进一步地,研究人员通过单细胞测序评估移植 BCs 后代的分子表型并将其与同一受体的内源性对应物进行比较,结果发现两者具有高度相关性,且比较 GFP + 和 GFP - 细胞中 BC 标记物的表达水平,并未发现明显的统计学差异(图 2)。
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图 2:小鼠原代 BC 体内移植和功能研究
接下来进行对小鼠 iBC 气道移植后的功能测试,研究人员用表达 GFP 的转录病毒标记携带 Nkx2-1mCherry 报告基因的 iBCs,方便后续筛选纯化后扩增培养,待扩增培养到移植所需细胞量后,再移植入造模成功的小鼠气道中。结果发现,iBC 在受损气道上皮的表达、移植效率、和对气道上皮的重构作用与原代 BC 移植效果一致。且免疫荧光结果也表明 GFP + 细胞表达 NKX2-1,并具有向 BCs、分泌细胞、纤毛细胞分化的能力,而在上皮层外或粘膜下腺体中并未检测到 GFP + 细胞的表达。研究人员随后跟踪观察了 4 例带有荧光素酶标记的 iBCs 移植后的受体小鼠,发现仅在气管或肺区域才可检测到移植细胞体内生物发光现象,且伴随时间稳定性。再次对移植 iBCs 后代的分子表型、同一受体的内源性对应物与对照气管进行单细胞测序后对比,发现 iBCs 没有显著影响内源性细胞的转录组结果,其仍然维持三系分化的能力。进一步地量化纤毛细胞的结构和功能后,发现 iBC 来源的纤毛细胞和内源性纤毛细胞之间在形态学、跳动频率和纤毛长度上没有显著的统计学差异。通过诱导已移植 iBCc 的受体小鼠发生第二次气道损伤,以检测供体来源的 BCs 是否可以响应体内移植后第二次损伤修复反应,结果表明移植的 iBCs 可以重新进入细胞周期并迅速增殖修复损伤,且第二次响应修复反应的细胞百分比含量与内源性细胞没有差异。此外,研究人员还发现 GFP + 的气管上皮再生能力即使在经历过 7 代移植后也没有被减弱,单细胞测序结果也证明了其基因表达稳定性,证实了移植小鼠 iBC 来源的细胞后在体内维持自我更新和分化功能。以上结果表明在小鼠 BC 和 iBC 的气道移植重建气道上皮的可行性(图 3)。
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图 3:小鼠 iBC 体内移植和功能研究
在成功建立了小鼠 BC 和 iBC 的气道移植方法后,研究人员试图使用同样的方法移植人原代 BC(HBECs) 和人 iBC 来进一步建立临床前模型。研究人员先后建立 GFP 标记的人 HBECs 和 tdTomato + 标记人 iBCs,达到移植所需细胞量后分别植入气道受损的 NSG 小鼠中。并检测不同供体来源细胞在受损气道上皮中的百分比含量,结果表明 HBEC 源供体(n = 4)占受损气管上皮的 15.97% ± 1.14%,而人 iBC(KOLF2 n=5;BU3-NGPT n = 11)占 1.831% ± 1.327%。免疫荧光结果显示,两者均表达与肺细胞发育有关的 NKX2-1 核蛋白,且有能力分化为三种不同类型的气道细胞:BCs、分泌细胞和纤毛细胞,并保留肺部细胞功能。针对 6 例受体小鼠气道的进一步单细胞对比测序结果表明,不同供体细胞转录组具有高度相似性,且两者均参与了气道主要三大谱系(BCs、分泌和纤毛)群的增殖分化,表明移植人 BC 和 iBC 可维持体内气道上皮的重建(图 4)。
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图 4:人 BC 和 iBC 体内移植重建气道上皮
总之,Kotton 团队的研究结果建立了外源性小鼠和人原代或 PSC 源基底干细胞的气道干细胞移植可以持久性地在体内重构气道干细胞室。作为未来可能基于细胞疗法的第一步,其中自体基因修复细胞可能最终被用于体内重组气道上皮功能,以治疗具有遗传性气道疾病的个体。该技术可以更有效地治疗和控制一系列遗传性或者是由特定基因突变引起的气道疾病,对肺部再生医学和各种气道和肺部疾病的细胞治疗策略中具有巨大的意义和前景。
▍以上内容来自伯桢生物编辑部
撰文:杨
编辑:噗啦啦啦啦
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